邢唷��>� 46���3������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������欹�5@ �� bjbj󒦮 8 璛璛 ������������������� ���� (D D D D D D D \^^^^^^$�R%���� D D � � ���D D �� � � � Z�D �D \� � \� � � ��� D  ��;�� R� \�0�� �f .�� ������� X�� PD �� r� V \� D D D ������d� ���Sheffield Molecular Genetics Facility Bird sex-typing using genetic markers by Deborah Dawson (D.A.Dawson @Sheffield.ac.uk) Technical Details For the confident assignment of sex in non-ratite birds we recommend that both the Griffiths et al. (1998: P2/P8) and Fridolfsson and Ellegren (1999: 2550F/2718R) sexing primers should initially be tested in order to identify the primers best suited to the study species.� Primer sequences: Griffiths et al. (1998: P2/P8) 燩2 = 5'-TCT GCA TCG CTA AAT CCT TT-3' 燩8 = 5'-CTC CCA AGG ATG AGR AAY TG-3' Fridolfsson and Ellegren (1999: 2550F/2718R) �2550F = 5'-GTT ACT GAT TCG TCT ACG AGA-3' �2718R = 5'-ATT GAA ATG ATC CAG TGC TTG-3' The usual protocol adopted by the Sheffield Molecular Genetics Facility is detailed here. DNA was extracted from blood following Bruford et al. (1998). Each 10-祃 reaction contained about 50 ng of genomic DNA, 1 礛 of each primer and 0.25 units Taq DNA polymerase (ThermoprimePlus, Advanced Biotechnologies) in the manufacturer抯 buffer (final concentrations 20 mM (NH4)2SO4, 75 mM Tris-HCl pH 9.0, 0.01% (w/v) Tween), including 2.0 mM MgCl2 and 0.2 mM of each dNTP. PCR amplification was performed in a Hybaid Touchdown thermal cycler.� If the concentration of high quality DNA is low (eg if DNA has been extracted from feathers) the following program should be used (the annealing temparature has been reduced, time at eact temperature and the number of cycles have been increased). In many cases this program is used as the first choice: The reaction profile used with the Griffiths et al. (1998) P2/P8 primers was:- 94癈 2 minutes� then:� 94癈 45 seconds 48癈 45 seconds 72癈 45 seconds for 40 cycles, followed by: 72癈 for 5 minutes The reaction profile used with the Fridolfsson and Ellegren (1999) 2550F/2718R primers was:- 94癈 2 minutes then:� 94癈 30 seconds 60癈 30 seconds (reducing by 1癈 each cycle),� 72癈 30 seconds for 1 cycle,� 94癈 30 seconds 59癈 30 seconds (reducing by 1癈 each cycle),� 72癈 30 seconds for 1 cycle,� etc, reducing annealing temperature by 1癈 each cycle until.. 94癈 30 seconds� 51癈 30 seconds (reducing by 1癈 each cycle),� 72癈 30 seconds for 1 cycle,� followed by: 94癈 30 seconds� 50癈 30 seconds� 72癈 30 seconds for 30 cycles.� followed by: 72癈 for 5 minutes The following profile used with the Griffiths et al. (1998) P2/P8 primers has been used in the past and works well for many species: 94癈 2 min then 94癈 15 s, 50癈 20 s, 72癈 25 s for 40 cycles followed by 72癈 for 1 minute. The PCR products were visualised either on 3% agarose gels stained with ethidium bromide, or on 5-6% polyacrylamide gels stained with silver (Promega) or analysed on an ABI 377 DNA sequencer. We would also like to draw attention to the potential difficulties in CHD-based molecular sexing caused by the presence of polymorphism such as that identified in auklets ( HYPERLINK "http://www.shef.ac.uk/misc/groups/molecol/Dawsonetal2001.pdf" Dawson et al. 2001).� References Bruford MW, Hanotte O, Brookfield JFY, Burke T (1998) Multilocus and single-locus DNA fingerprinting. In: Molecular Genetic Analysis of Populations: A Practical Approach, 2nd edition, (ed. Hoelzel AR), pp. 287-336. IRL Press, Oxford.�  HYPERLINK "http://www.shef.ac.uk/misc/groups/molecol/Dawsonetal2001.pdf" Dawson DA, Darby S, Hunter FM, Krupa AP, Jones IL and Burke T (2001) A critique of CHD-based molecular sexing protocols illustrated by a Z-chromosome polymorphism detected in auklets (Aves: Alcidae, Laridae). Molecular Ecology Notes, 1, 201-204. Fridolfsson AK and Ellegren H (1999) A simple and universal method for molecular sexing of non-ratite birds. Journal of Avian Biology, 30, 116-121. Griffiths R, Double MC, Orr K and Dawson RJG (1998) A DNA test to sex most birds. Molecular Ecology, 7, 1071-1075. &LM|���� � � � � � " Y | � � X d � D� bc����������  �������  黠赈镛邹镛邹娃娃娃娃妻赁赁罐钩罐镛罐钩〕罐妻妻�hh�?�0J5乗�h�?�0J6乚� h�?�0Jjh�?�U h�?�>* h�?�5乗�h�?�OJQJ^J h�?�6乚�h�?�h�?�h�?�\� h�?�\�h�?�5�>*\�ha} h�?�\�1&L|�� � $ �  � � F��"��;����������������������������������gd�?�gda} $a$gda}  ��  ���gd�?�gd�?�6&P 1怓:p糶n皟. 叭A!皀"皀#恘$恘%�芭芭 惸�@@�@ NormalCJ_HaJmH sH tH DA@��D Default Paragraph FontRi@��R  Table Normal�4� l4�a� (k@��(No ListJ^`�J �?� Normal (Web)[$\$mH sH 4U`�4 �?� Hyperlink >*ph�  ����&L|���$���F��"��;�� � � � � � �  �0€€0�0€€p�0€€�0€€p�0€€p�0€€�0€€�0€€�0€€€�0€€�0€€ €�0€€�0€€€�0€€€�0€€�0€€�0€€€�0€€�0€€�0€€�0€€�0€€�0€€��0€€�0€€�0€€�0€€�0€€�0€€ €�0€€���$���F��"��;�� � � � � � �  Oy0�@Oy0�Oy0�Oy0�Oy0�Oy0�Oy0�Oy0�Oy0�Oy0�Oy0�Oy0�Oy0�Oy0�Oy0�Oy0�Oy0�Oy0�Oy0�Oy0�Oy0�Oy0�My0€@My0€ �(簪     b � � � � X��X��� 皑�T�报�题波�苑敞�\ 川�虧!胆�詆!定�4�法�\�辅�匊龚�\�酣�� � � � �     ""� � � � �    9*€urn:schemas-microsoft-com:office:smarttags€State€8 *€urn:schemas-microsoft-com:office:smarttags€City€9 *€urn:schemas-microsoft-com:office:smarttags€place€   _i,3jl����&()1FK\^mox|����Wb}�  $ + > F [ i � � � � � � � �   � � � � � � LN��������n 333333*F� �   ��bo1dad�'pnD~=�'p��ddZTn_�'p��dd� 7{a} 嶦CWHi&]糶n�t瓼�=��?�a�i~�C��@€l輰� `@��Unknown������������G�噝 €�Times New Roman5�€Symbol3&� 噝 €�Arial?5� 噝 €�Courier New"q�鹦h亴拞搶拞>� >� !�nnx�倐243��H)�?����������������������a���%Sheffield Molecular Genetics Facilitybo1dadbo1dad�鄥燆鵒h珣+'迟0�������� , H T `lt|��&Sheffield Molecular Genetics Facilityofhefbo1dadlo1do1d Normal.dotobo1dadd11dMicrosoft Word 10.0@^胁@V��@B�&�>� �胀諟.摋+,D胀諟.摋+,P  hp|��� ���� � ��UOSA &Sheffield Molecular Genetics Facility Title� 8@ _PID_HLINKS�Ad N=http://www.shef.ac.uk/misc/groups/molecol/Dawsonetal2001.pdfN=http://www.shef.ac.uk/misc/groups/molecol/Dawsonetal2001.pdf ������ !"���$%&'()*���,-./012������5���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������Root Entry�������� �F袃�;�7€Data ������������1Table�����WordDocument����8 SummaryInformation(������������#DocumentSummaryInformation8��������+CompObj������������j���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ���� �FMicrosoft Word Document MSWordDocWord.Document.8�9瞦